卷烟烟气对小鼠肠道菌群及口腔菌群的影响分析

精选论文 2020-06-30 08:20123未知xhm
  摘要:目的:分析卷烟烟气对小鼠肠道菌群及口腔菌群的影响。方法:采用卷烟烟气浸出物灌胃、被动吸烟不同处理方式对小鼠肠道及口腔部位菌群影响进行分析。结果:灌胃组中肠道乳酸杆菌、双歧杆菌菌落数目明显低于对照组,口腔变形链球菌菌落数目明显呈增加趋势,差异有统计学意义(P<0.05);两组大肠埃希菌菌落数目比较,差异无统计学意义(P>0.05);与空白组比较,被动吸烟组中肠道内乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠埃希菌菌落数无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),而口腔变形链球菌菌落数明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:卷烟烟气浸出物可破坏小鼠肠道菌群、口腔菌群间平衡性;而被动吸烟仅使口腔菌群平衡破坏。
  关键词:卷烟烟气 小鼠肠道菌群 口腔菌群 影响 分析

  目前阶段,多国家研究者研究了人体微生物与代谢疾病的关系,使研究员可在不同的影响因素情况下,能对人体微生物构成产生的影响进行准确判断,易判定疾病与健康间联系。不同微生物群落存在于人体及动物体肠胃、口腔、泌尿器官等处。而正常肠道菌群具有多种功能(抗衰老、免疫、生物拮抗、营养、抑癌等)。正常情况下微生物数量及种类维持稳定,各菌群相互制约和协调,使体内各部位微生态维持平衡[1-2]。但此种平衡具有相对性,一旦机体遭受任何刺激,菌群的正常生长部位均发生改变或已打破各菌群间制约性,从数量和代谢产物上菌群内微生物改变较大。吸烟草破坏机体菌群微生态平衡,影响宿主的健康状态,增加了心血管病、癌症等患病风险。因此,卷烟烟气的安全性和所含的化学成分活性备受关注。目前卷烟烟气如何影响动物体内的菌群,国内尚未有类似研究[3]。为此,采用不同方法处理小鼠(灌胃被动吸烟或烟气浸出物),比较不同方式对小鼠肠道及口腔菌群的影响。

  资料与方法

  材料:滤嘴卷烟(烤烟型,焦油量11 mg,烟碱量0.9,烟气CO释放量14 mg);SPE小鼠;蛋白胨;葡萄糖;酵母粉;琼脂;其他试剂均为常规市售分析纯。自制被动吸烟装置;制备自制烟气浸出物装置;厌氧培养箱;pH计;系列立式灭菌剂;电子天平;超净工作台。
  培养基及其条件:按如下实验制备方法进行操作[4-9]:(1)乳酸杆菌实验室自制SL培养基:培养基内含有的主要组分包括葡萄糖20 g,蛋白质10 g,柠檬酸二胺2 g,乙酸钠25 g,酵母粉5 g,吐温800.1 mL,磷酸氢二钾6 g,硫酸镁0.58g,硫酸锰0.15 g,硫酸亚铁0.03 g,琼脂15 g。使最终pH值调节为5.7。经121℃灭菌15 min。(2)双歧杆菌:实验室制PTYG培养基:1 L培养基内主要组分包括胰蛋白胨5 g,大豆蛋白胨5 g,酵母菌10 g,葡萄糖10 g,吐温801 mL,无机盐溶液40 m L,0.1%刃天青1 mL,半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L(培养基内煮沸后并在分装前加),琼脂15 g,最终调节pH值范围,大肠埃希菌,113℃灭菌0.5 h后制板。(3)自制实验室麦康凯培养基:1 L培养基内含主要组分:蛋白胨20 g,猪胆盐5.0 g,氰化钠5.0 g,乳糖10.0 g,琼脂18.0 g,5 m L 1%、0.5%中性红水液,最终调节pH值范围7.3。琼脂、乳糖猪胆盐、中性红水液除外,混合,加热溶解后用Naoh调节p H值,加琼脂后煮沸,待琼脂溶后再过滤。加猪胆盐、乳糖、中性红水液,再分装均匀,115℃下经30 min灭菌,制平板,备用,避光保存。(4)变形链球菌:自制实验轻唾杆菌肽琼脂培养基为1 L培养基内含月示蛋白胨5.0 g,胰蛋白胨6.0 g,1.0个葡萄糖,鱼肉蛋白胨9.0 g,台盼荔75.0 mg,蔗糖50.0 g,磷酸氢二钾4.0 g,结晶紫0.8mg,琼脂15.0 g主要成分,调节pH值为7.2,121℃温度下进行15 min的荔压灭菌,冷却至60℃,无菌条件下加入1mL 1%呀硫酸钾、0.2 U/mL浓度的杆菌肽,称之为MSBA培养基,制备平板。
  动物及相关分组:健康雄性SPF小鼠48只,体重均控制在25~29 g,喂养在符合标准要求的鼠房内,室内温度经设置并控温为22℃左右、湿度设57%确保室内的光暗循环维持在12 h。以基础饲料在整实验期内饲喂小鼠,饮食较自由。小鼠采购后需连续1周的喂养,经随机数字表法分8个组别,空白组、对照组、灌胃1组、灌胃2组、灌胃3组及被动吸烟1、2、3组,各组设6只。对照组经灌胃后给生理盐水0.5 mL/d,灌胃1组给烟气浸出物0.25 mL/d,灌胃2组灌胃给烟气浸出物0.5 mL/d,灌胃3组灌胃给烟气浸出物1.0 mL/d;在每日清晨灌胃1次,连续21 d灌胃,空白组不做任何形式处理;被动吸烟1组每日上午熏1次烟气,被动吸烟2组每日熏2次烟,上、下午时间各为1次;被动吸烟3组每日熏烟4次,分别在上下午各两次,其每次点燃一支烟后,设置真空泵2 L/min的工作流速。打开吸烟装置右上方通风孔,小鼠在烟气环境下需持续进行0.5 h/次,且连续21 d熏烟。在实验前后对各组的小鼠进行称重,记录实验前、后体重变化。
  分析肠道菌群:第21天时小鼠进行处死,立即在无菌操作室内称结肠内容物0.5 g于2 mL的无菌离心管内;结肠内容物与加灭菌生理盐水混合,振荡器充分震荡漩涡;在静置条件下依次采用梯度洗脱,选其中的适宜稀释50μL样品在选择培养基内分别培养接种,每稀释度制备3个平行板。接种乳酸杆菌、双歧杆菌后置厌氧培养箱内,培养条件设置37℃、72 h;大肠埃希菌接种在电热恒温培养箱内培养,设置条件37℃、24 h。
  口腔变形链球菌:21 d处死小鼠后,立即用注射器在无菌操作室注于小鼠口腔无菌生理盐水1 mL,经润洗后流入无菌离心管15 mL内;立即在无菌离心管内将唾液样本充分震荡60 s,连续用无菌生理盐水进行梯度性稀释,至10-i-10-5。选适宜稀释度细菌稀释液,取50μL在直径7.5 cm含轻唾平皿培养基中进行接种。各稀释度采用3个平行板,在平板中央接种液滴,用经灭菌的L型玻璃棒均匀涂布置在厌氧培养箱,设置培养参数37℃、72 h。
  统计学方法:采用SPSS 14.0统计学软件分析数据。计量资料以表示,采用t检验;计数资料以[n(%)]表示,采用χ2检验;P<0.05为差异有统计学意义。

  结果

  灌胃组、被动吸烟组小鼠体重测定:灌胃后各组小鼠体重均有增加;与对照组(4.06±0.35)g比,灌胃组小鼠体重增加呈大大降低;与灌胃1组(2.77±0.31)g、2组(2.35±0.29)g比,灌胃3组(1.73±0.27)g体重增加有明显降低趋势。被动吸烟前后小鼠体重增加量空白组为(4.11±0.38)g、被动吸烟1组为(-1.52±0.57)g、被动吸烟2组为(-1.57±0.49)g、被动吸烟3组为(-1.84±0.47)g。被动吸烟后空白组小鼠体重大幅增加;与被动吸烟前比,被动吸烟各组小鼠体重无增加,且在不断下降。
  各种烟气浸出物灌胃小鼠肠道菌群、口腔变形链球菌比较:与对照组比较,灌胃组乳酸杆菌和双歧杆菌菌落数目均降低,差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,灌胃组大肠埃希菌菌落数增加,差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,灌胃组变形链球菌落数目增加,且烟气浸出物低浓度组增加数明显高于中、高浓度组。被动吸烟组与空白肠道双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌的菌落数目比较,差异有统计学意义(P<0.05);而被动吸烟组变形链球菌菌落数明显较空白组增加,各剂量组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1~2。

  表1 烟气浸出物灌胃小鼠肠道菌群、口腔变形链球菌(±s,Lg CFU/g) 
  
  表2 被动吸烟小鼠肠道菌群、口腔变形链球菌值(±s,Lg CFU/g) 
  

  讨论

  卷烟烟气主要由多种化学物质组成,具有复杂的混合物,其中多成分对细胞或机体存在一定毒性[10]。为分析卷烟烟气对机体存在的危害,对体内外毒性方面进行系列基础性相关研究具有必要性。
  经评价不同组内小鼠肠道菌群、口腔变形链球菌菌落可知,灌胃卷烟烟气浸出物可破坏小鼠肠道菌群及口腔菌群间的平衡;被动吸烟仅对口腔菌群平衡破坏性,但对肠道菌群无明显影响。

  参考文献
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