17β-HSD3在SD大鼠肾脏中的表达及其功能

科教论文 2020-05-12 08:38121未知xhm
  摘要:目的 基于对性激素合成的重要催化酶17β-HSD3在大鼠肾脏中表达情况以及功能的研究,探索肾脏组织合成性激素的作用通路。方法 将大鼠肾脏细胞分为4组,A组以RPMI 1640培养液培养24 h,B组以RPMI 1640培养液培养48 h,C组用加入LH 10 U/L的RPMI 1640培养液培养24 h,D组用加入LH 10 U/L的RPMI 1640培养液培养48 h,观察各组大鼠肾脏细胞的形态,并利用Western blot和放射免疫分析法分别检测各组肾脏细胞中17β-HSD3的表达情况和睾酮(T)、孕酮(P)和雌二醇(E2)的含量。结果 LH未干扰大鼠肾脏细胞的形态及生长状态。RPMI 1640培养液培养24 h后,大鼠肾脏细胞内的17β-HSD3蛋白表达量较低(0.201±0.058),同时上清液中的T、P和E2含量较低[分别为(89.22±11.76)nmol/L,(7.21±1.55)pmol/L和(19.49±2.91)nmol/L],RPMI 1640培养液培养48 h后上述指标变化不大(均P>0.05);而在加入LH的RPMI 1640培养液培养24 h后,大鼠肾脏细胞内的17β-HSD3蛋白表达量明显升高[(1.826±0.039),P<0.01],同时上清液中的T、P和E2含量明显增加[分别为(131.19±10.25)nmol/L,(23.33±3.72)pmol/L和(39.43±3.59)nmol/L,均P<0.05],培养48 h后上述指标与24 h差异无统计学意义(均P>0.05)。结论 大鼠肾脏中有性激素合成的重要催化酶17β-HSD3的表达,在LH的作用下17β-HSD3表达量升高,并能够促进性激素的分泌,说明肾脏组织具有生成性激素的作用,有望明确肾脏组织生成性激素的作用通路。
  关键词:肾脏; 17β-HSD3; 性激素;

  17β-羟类固醇脱氢酶3(17β-HSD3)为类固醇脱氢酶家族亚型之一,主要作用是催化还原雄烯二酮生成睾酮,是睾酮合成过程中最后步骤的催化酶,也具有将雌酮转变为雌二醇的次要作用[1]。由于17β-HSD3的作用是催化还原雄烯二酮生成睾酮,所以17β-HSD3主要在睾丸组织表达,在前列腺和脂肪组织内也有少量的表达[2]。
  有国外实验发现大鼠肾脏组织可分泌性激素,但未做深入研究,直到一些与性激素生成有关的重要酶类以及调控性激素生成通路上的一些分子被揭示存在于大鼠肾脏组织后,肾脏生殖内分泌功能才逐渐引起了学者们的关注。本课题组沿着这一思路大胆推测大鼠肾脏组织可能具备合成性激素的作用,并进行了相关实验研究,实验结果在国外研究的基础上有了更多的发现,越来越多的与性激素生成有关的重要酶类以及调控性激素生成通路上的分子和受体陆续被证实存在于大鼠肾脏组织。17β-HSD3是性激素生成过程中的重要催化酶,目前还不清楚其在大鼠肾脏组织内的表达情况以及其能否对大鼠的生殖内分泌功能产生影响。由于17β-HSD3的主要作用是催化还原雄烯二酮生成睾酮,而睾酮的分泌主要受黄体生成素(LH)的调节,血睾酮水平对下丘脑和垂体起负反馈作用,故本实验拟通过观察17β-HSD3在大鼠肾脏组织中的表达情况以及LH作用下对其功能的影响,在原有实验基础上更加深入和清晰地研究大鼠肾脏组织生成性激素的作用通路。

  1 材料与方法

  1.1 主要实验材料
  1.1.1 实验动物
  健康清洁级SD大鼠40只,雄性,体重220~250 g,9周龄,动物合格证号:SCXK(陕)2015-003,由西安交通大学医学院动物实验中心提供并饲养于该中心,普通饲料饲养,自由摄食和饮水,室温控制在20~25℃,保证空气流通,自然光照。
  1.1.2 主要试剂和仪器
  兔抗17β-HSD3多克隆抗体(美国Thermo公司);黄体生成素(美国Thermo公司);睾酮(T)放射免疫测定试剂盒(安徽博美生物科技公司);孕酮(P)放射免疫测定试剂盒(安徽博美生物科技公司);雌二醇(E2)放射免疫测定试剂盒(安徽博美生物科技公司);Western blot试剂盒(美国Novagen公司);西班牙琼脂糖(美国Thermo公司);SCW-BCM生物超净工作台(苏州市长春电子仪器厂);GC-1200r放射免疫计数器(安徽合肥机电有限公司);凝胶成像系统(美国UVP公司)。
  1.2 实验方法
  1.2.1 大鼠肾脏细胞的制备
  将40只SD大鼠随机分为4组,每组10只,分别标记为A、B、C、D组。将各组大鼠肾脏组织取出,放置在无菌培养皿中,除去包膜,剪取肾皮质部分,用PBS液反复冲洗剪碎的组织块,消化后离心,RPMI 1640培养液培养,定时换液,最后计算细胞密度,观察细胞形态。将4组SD大鼠肾脏细胞按照30万/瓶的细胞密度分别放入孔板内。A组采用RPMI 1640培养液培养,24 h后显微镜下拍照;B组采用RPMI 1640培养液培养,48 h后显微镜下拍照;C组采用加入LH 10 U/L的RPMI 1640培养液培养,24 h后显微镜下拍照;D组采用加入LH 10 U/L的RPMI 1640培养液培养,48 h后显微镜下拍照。
  1.2.2 Western blot检测
  各组分别收集细胞10×106个,用预冷的PBS液洗涤细胞2次,加入预冷的总蛋白提取液,混匀。BCA法测定细胞总蛋白的浓度,选取100 μg/mL浓度的蛋白进行凝胶电泳,用转膜装置实施转膜。转膜结束后,将取出的NC膜放入配制好的封闭液,封闭结束后加入稀释的17β-HSD3多克隆抗体,洗膜3次,加入稀释好的二抗,封口,室温摇床孵育2 h。洗膜4次,再加入ECL化学发光液,放进X线片暗盒内,曝光后取出X线片,放在显影液中显影。显影后将X线片放入定影液内定影,胶片透明后终止,冲去定影液,晾干,拍照。最后利用凝胶成像系统计算出各条带的吸光度值,以17β-HSD3蛋白与内参蛋白条带的吸光度比值作为17β-HSD3蛋白的相对表达量。
  1.2.3 放射免疫检测
  各组分别收集细胞10×106个,按照放射免疫分析试剂盒说明书进行操作。在每组细胞上清液加入睾酮(T)、孕酮(P)和雌二醇(E2)抗体,相应标准品、荧光标记物以及缓冲液等试剂。37℃水浴45 min,再加入分离剂,混匀,室温放置15 min。3500 r/min,离心15 min,吸取上清液。利用GC-1200r放射免疫计数器进行放射性检测,最终获得细胞上清液中T、P和E2的含量。
  1.3 统计学方法
  使用SPSS 19.0统计学软件进行相关的统计学分析,计量资料以x¯±s表示,组间均数比较采用t检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。

  2 结果

  2.1 各组大鼠肾脏细胞形态学观察
  使用RPMI 1640培养液培养的肾脏细胞,培养24 h后(A组)肾脏细胞呈梭形,边缘清晰,形态一致,细胞均质而透明,生长旺盛;培养48 h后(B组)肾脏细胞随着培养时间的延长,细胞的数量和密度逐渐增加,其余同A组细胞。使用含有LH培养液培养的肾脏细胞,培养24 h后(C组)肾脏细胞呈梭形,边缘清晰,形态一致,细胞均质而透明,生长旺盛;培养48 h后(D组)肾脏细胞随着培养时间的延长,细胞的数量和密度逐渐增加,其余同C组细胞。由此可以看出,4组肾脏细胞除随时间变化而出现的细胞数量和密度有所不同外,形态及生长状态相似(图1),说明LH不会干扰大鼠肾脏细胞的形态及生长状态。

  
  图1 各组大鼠肾脏细胞的形态学观察(×200)
  Fig.1 Morphological observation of renal cells in each group(×200)
  2.2 各组大鼠肾脏细胞中17β-HSD3蛋白的表达
  4组大鼠肾脏细胞内都有17β-HSD3蛋白的表达(图2)。A组和B组大鼠肾脏细胞内的17β-HSD3蛋白表达量较低,相对表达量分别为(0.201±0.058)、(0.218±0.063),两组间差异无统计学意义(P>0.05);C组和D组大鼠肾脏细胞内的17β-HSD3蛋白表达量明显升高,相对表达量分别为(1.826±0.039)、(1.764±0.041),两组间差异无统计学意义(P>0.05),但与A组比较差异均有统计学意义(分别为P=0.0021,P=0.0025)。
  
  图2 Western blot检测17β-HSD3在各组大鼠肾脏细胞内的表达
  Fig.2 Expression of 17β-HSD3 in kidney cells of the four groups
  2.3 各组大鼠肾脏细胞上清液中性激素水平变化
  4组大鼠肾脏细胞的上清液内都可检测出T、P和E2的分泌。表1可见:A组和B组大鼠肾脏细胞上清液中的T、P和E2含量较低,且两组间T、P和E2含量差异均无统计学意义(均P>0.05);C组大鼠肾脏细胞上清液中的T、P和E2含量明显升高,均大于A组,差异均有统计学意义(分别为P=0.041,P=0.013,P=0.029);C组和D组大鼠肾脏细胞上清液中的T、P和E2含量差异均无统计学意义(均P>0.05)。
  表1 各组大鼠肾脏细胞上清液中性激素水平变化(x¯±s,n=10)
  

  3 讨论

  肾脏的内分泌功能一直是国内外学者关注的热点,但目前有关肾脏的生殖内分泌功能的研究仍处于起步阶段,需要深入探索。虽然国外有学者运用放射免疫分析法发现大鼠肾脏组织中有性激素的存在,主要为孕烯醇酮、雌酮和睾酮[3],也有关于大鼠肾脏组织中存在胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、细胞色素P450芳香化酶(P450arom)、17α-羟化酶(P450c17)、转运蛋白(TSPO)、类固醇合成急性调节蛋白(StAR)、类固醇生成因子-1(SF-1)和3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)这些与性激素生成有关的重要酶类以及调控性激素生成通路上的分子的报道[4-9],但国外实验并没有针对大鼠肾脏组织是否能够产生性激素做专门的研究,只是在做别的研究中附带发现的。本课题组沿着这一思路将这些文献信息进行整合,针对大鼠肾脏具备产生性激素的功能做了系列研究,并首次证实了大鼠肾脏组织中存在促卵泡激素受体(FSHR)、黄体生成素受体(LHR)和17β-羟类固醇脱氢酶1(17β-HSD1)这些与性激素生成有关的重要酶类和受体[10-13]。以上研究提示,大鼠肾脏组织中存在与性激素生成有关的重要酶类以及调控性激素生成通路上的分子和受体,而17β-HSD3是性激素生成过程中的重要催化酶,目前还不清楚其在大鼠肾脏组织内的表达情况以及能否对大鼠的生殖内分泌功能产生影响,需要实验进行验证。
  17β-羟类固醇脱氢酶(17β-HSDs)是一类NAD-(P)H/NAD(P)+依赖的氧化还原酶,其主要功能是参与性激素的代谢,通过调节细胞内甾体类激素水平从而在生殖系统中发挥重要作用。它有14种异构酶,分别为17β-HSD1~14[14]。其中,17β-HSD3主要表达于睾丸微粒体中,主要作用是将雄二酮转化为睾酮,还能将脱氢表雄酮转化为雄烯二酮,也有将雌酮转化为雌二醇的次要作用,因此17β-HSD3是睾酮合成过程中最后步骤的重要催化酶[15]。在性激素的合成过程中,下丘脑分泌的GnRH与垂体促性腺细胞膜上的高亲和性受体相结合,促进LH的生成。LH与其在相应细胞上的特异性受体LHR结合后,促进cAMP的生成,并活化细胞内的cAMP/PKA信号转导通路,使17β-HSD3基因顺利表达,生成17β-HSD3,继而产生性激素[16]。本实验首次证实了大鼠肾脏组织存在17β-HSD3蛋白的表达,并在大鼠肾脏细胞上清液内检测到了T、P和E2,当给予大鼠肾脏细胞高剂量LH干预时,大鼠肾脏内17β-HSD3蛋白的表达量显著增加,大鼠肾脏细胞上清液内的T、P和E2含量也明显提高。据此说明,大鼠肾脏组织中有17β-HSD3的表达,且17β-HSD3参与大鼠肾脏组织合成性激素的过程。但目前研究仅从体外实验证实高剂量LH能够提高大鼠肾脏细胞17β-HSD3蛋白的表达量,尚未进行体内实验予以证实,主要考虑到体内的LH是在下丘脑-垂体的调控下合成的,如果给予外源性LH体内注射,不排除对机体内合成的LH有负反馈抑制作用以及干扰体内的激素水平,从而对17β-HSD3的调节作用有一定的影响,所以暂未行体内实验,但本课题组会继续寻找合适的体内模型完成体内实验。同时课题组还将继续研究其他肾脏细胞系、其他鼠类或其他动物的肾脏是否也有这样一条合成性激素的途径以及调控性激素合成的详细分子通路。
  国外学者及本课题组的这些发现更新了此前人们对于合成性激素的器官仅为生殖器官的理论,对人类肾脏新的内分泌功能有了新的认识,但肾脏具备合成性激素的能力对于人体有哪些作用和重要性仍需要进一步的探索和研究。
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