体外沉默法尼基转移酶对舌鳞状细胞癌迁移和侵袭的影响

医学论文 2020-08-10 08:40144未知xhm
  摘要:目的 通过RNA干扰沉默法尼基转移酶(FTase),探讨沉默FTase对舌鳞状细胞癌迁移和侵袭的影响及其相关机制。方法 针对FTase设计并构建3条小干扰RNA(siRNA),转染人舌鳞状细胞癌CAL27和SCC-4细胞(实验组),同时设置阴性对照组(转染NC-siRNA)和空白对照组(不转染siRNA)。应用实时荧光定量PCR检测各组细胞FTase、HRAS的mRNA表达,根据FTase mRNA的表达量,选取沉默效率最高的FTase-siRNA转染组作为进一步研究的实验组。蛋白质免疫印迹法检测各组细胞FTase、HRAS、p65、p-p65(S536)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、低氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表达,Transwell侵袭实验和细胞划痕实验检测各组细胞的侵袭和迁移能力。结果 与阴性对照组和空白对照组相比,实验组FTase的mRNA和蛋白表达下降(P<0.05),HRAS的mRNA和蛋白表达无明显变化(P>0.05),p-p65(S536)、MMP-9、HIF-1α、VEGF蛋白表达下降(P<0.05),p65蛋白表达无明显变化(P>0.05);实验组的细胞侵袭和迁移能力降低(P<0.05)。结论 体外沉默舌鳞状细胞癌细胞FTase,可以抑制细胞体外迁移和侵袭能力,为FTase可能作为舌癌治疗的分子靶点提供了一定的理论和实验依据。
  关键词:法尼基转移酶 舌鳞状细胞癌 迁移 侵袭

  口腔癌多为鳞状细胞癌,其中舌鳞状细胞癌约占所有口腔癌的30%[1]。舌鳞状细胞癌具有生长快、浸润性强的特点,5年存活率约60%[2]。局部复发、淋巴结转移和远处转移是舌鳞状细胞癌预后差的主要因素。因此,阐明舌鳞状细胞癌迁移和侵袭的分子机制和确定其治疗靶点,对于临床诊断和治疗至关重要。
  法尼基转移酶(farnesyltransferase,FTase)是由FNTA基因编码的α亚单位和FNTB基因编码的β亚单位组成[3]。FTase识别RAS蛋白的C末端CAAX基序,并将法尼基二磷酸中的法尼基团转移至CAAX基序中的半胱氨酸巯基上[4]。这一步是RAS蛋白的细胞膜定位和生物活性发挥所必不可少的[5-6]。法尼基化的RAS蛋白相当于信号转导的开关,RAS蛋白在肿瘤的形成和发展过程中起重要作用[7-9],RAS蛋白控制细胞信号通路参与细胞生长、迁移、黏附、细胞骨架完整性、生存和分化等功能[10-11]。口腔癌中RAS基因以HRAS突变较为常见,HRAS基因突变和扩增分别约为11.2%和13.8%[12]。由于HRAS只能被FTase修饰[13-14],因此针对口腔癌HRAS突变或高表达患者,抑制FTase功能进行抗肿瘤治疗可能具有一定的疗效,然而在口腔最常见恶性肿瘤舌鳞状细胞癌中,这方面的研究相对较少。研究显示,核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)与HRAS致癌基因激活的异常细胞增殖和致瘤性密切相关[15-16],而NF-κB可调控侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶9(matrixmetalloprotein-9,MMP-9)的转录活动[17]。通过检索Oncomine数据库中FTase β亚单位编码基因FNTB,其癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)头颈鳞状细胞癌数据集中显示FNTB与低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的共表达相关系数为0.982,表明FNTB与HIF1α表达相关性很高。
  研究[18-19]表明,在口腔癌中HIF1α调控血管生成和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达。本研究利用RNA干扰技术,以人舌鳞状细胞癌CAL27和SCC-4细胞为研究对象,通过舌鳞状细胞癌细胞系体外实验,检测抑制FTase是否会影响NF-κB的p65亚单位的磷酸化和通过HRAS下游的NF-κB通路影响细胞的侵袭,此外还检测抑制FTase是否会影响HIF-1α的表达和血管生成,探讨沉默FTase对舌鳞状细胞癌迁移和侵袭的影响及其相关机制。

  1 材料和方法

  1.1 材料和试剂
  人舌鳞状细胞癌细胞系CAL27购自中南大学高等研究中心, SCC-4由山东大学口腔医学院馈赠。
  DMEM基础培养基、胎牛血清(BI公司,以色列),胰蛋白酶(Gibco公司,美国),RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、2×Sybr Green qPCR Mix(北京艾德莱生物科技有限公司),青霉素、链霉素(Gibco公司,美国),二甲基亚砜(dimethylsul-foxide,DMSO)(Amersco公司,美国),小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)片段设计、合成及riboFECTTM CP转染试剂(广州锐博生物科技有限公司)。兔抗人多克隆抗体HIF-1α、VEGF、FTase、HRAS和鼠抗人单克隆抗体p65(Affinity Biosciences公司,美国),兔抗人多克隆抗体p-p65(S536)、MMP-9、GAPDH、羊抗兔IgG二抗、羊抗鼠IgG二抗(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司),Transwell小室(Corning公司,美国),RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液(北京索莱宝生物科技有限公司)。实时定量聚合酶链反应(poly--merase chain reaction,PCR)引物FTase、HRAS、GAPDH由上海生工生物工程有限公司合成。
  1.2 细胞培养
  细胞培养用含10%胎牛血清、青霉素100 U·mL-1和链霉素100 mg·mL-1的DMEM培养基,放于37 ℃、5%CO2恒温孵育箱中培养。待细胞铺满瓶底约90%后,进行消化,以1︰2的比例接种至新的培养瓶中。
  1.3 siRNA转染
  针对FTase基因序列设计3条FTase-siRNA(表1)和1条阴性对照序列。转染前1 d以每孔5×105个舌鳞状细胞癌CAL27和SCC-4细胞接种于6孔板中,待细胞密度达30%~50%时进行转染。用120 μL ribo-FECTTMCP Buffer稀释8 μL 20 μmol·L-1 siRNA储存液(转染时siRNA终浓度为80 nmol·L-1),室温孵育5 min。加入12 μL riboFECTTM CP转染试剂,轻轻吹打混匀,加入到1 860 μL更新的无双抗完全培养基中。转染后48 h检测基因的表达。实验分为3组:实验组、阴性对照组、空白对照组。其中实验组为3个FTase-siRNA转染组,分别转染3条FTase-siRNA;阴性对照组为NC-siRNA转染组,转染NC-siRNA;空白对照组仅加入等量转染试剂,不转染任何siRNA。
  表 1 针对FTase基因序列设计3条FTase-siRNA
  FTase-siRNA 产品编号 产品名称 靶序列
  FTase-siRNA-1 siG000002342A si-h- FNTB _001 ACGACTCGGTGGAAACAGT
  FTase-siRNA-2 siG131030103527 si-h- FNTB _002 CGAGTTCTTTCACCTACTA
  FTase-siRNA-3 siG000002342C si-h- FNTB _003 CGTCCATAGAACAGGCAAA
  1.4 实时荧光定量PCR检测各组细胞FTase、HRAS的mRNA表达
  转染24 h后,提取各组细胞总RNA,紫外光分光光度计检测RNA纯度和浓度。利用反转录试剂盒合成cDNA,以合成cDNA为模板进行荧光定量PCR。FTase的引物序列:上游5’-GGTGGATGTGAGAAG-CGCATA-3’,下游5’-GGCCAGGCCACAGAAGGT-ATA-3’;HRAS的引物序列:上游5’-GGCAGGAG-ACCCTGTAGGAG-3’,下游:5’-GGTTCACCTGT-ACTGGTGGAT-3’;GAPDH的引物序列:上游5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’,下游5’-TGGT-GAAGACGCCAGTGGA-3’。PCR反应条件:95 ℃预变性2 min,然后95 ℃变性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸31 s,共计40个循环。荧光信号实时监测和数据分析由ABI PRISM 7000实时荧光定量PCR仪自动完成,采用2-ΔΔCt公式计算mRNA的相对表达水平,其中Ct值为循环阈值。选取3个FTase-siRNA转染组中沉默效率最高的一组作为后续的实验组,进行进一步研究。
  1.5 蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测目的蛋白的表达
  siRNA转染48 h后,提取各组细胞中的蛋白质,应用BCA试剂盒进行蛋白质浓度测定。100 ℃变性10 min,每泳道50 μg蛋白,在10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离后,采用湿转法将蛋白转至PVDF膜,用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h。加入一抗[FTase,1︰1 000;HRAS,1︰1 000;p65,1︰1 000;p-p65(S536),1︰500;MMP-9,1︰500;HIF-1α,1︰1 000;VEGF,1︰1 000],在4 ℃下孵育过夜。用TBST洗涤后,将膜与二抗(1︰10 000)在室温下摇床孵育1 h。加入电化学发光(electrochemilumi-nescence,ECL)液显色、曝光。以测定蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值表示其蛋白相对表达水平。
  1.6 Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力
  将铺好人工基质胶Transwell侵袭小室置于室温,上室和下室各加入0.5 mL的DMEM基础培养基,置37 ℃培养箱中水化2 h。将转染48 h的舌鳞状细胞癌细胞消化后,用无血清培养液调整为8×104个·mL-1的细胞悬液。Transwell上室中加入500 μL细胞悬液,下室中加入750 μL含10%胎牛血清的培养液,在37 ℃、5%CO2细胞培养箱培养48 h。然后用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)清洗,用棉签轻轻拭去上层未迁移细胞,置于甲醛室温固定15 min,吸干上室固定液,置于0.1%结晶紫中室温染色20 min。蒸馏水冲洗后,显微镜下拍照,随机选取5个视野计数穿过膜的细胞数。实验重复3次。
  1.7 细胞划痕实验检测细胞的迁移能力
  用记号笔于6孔板背部间隔0.5~1.0 cm画5条横线。将转染24 h细胞(每孔5×105个细胞)接种在6孔板上。当细胞达到90%汇合时,用200 μL枪头垂直背部横线划痕。然后用PBS冲洗3次,加入无血清的培养基继续培养48 h,分别于划痕的0、24、48 h观察并拍照测定细胞迁移能力。实验重复3次。24 h划痕相对愈合面积=(0 h划痕面积-24 h划痕面积)/0 h划痕面积,48 h划痕相对愈合面积=(0 h划痕面积-48 h划痕面积)/0 h划痕面积[20]。
  1.8 统计学分析
  采用SPSS 19.0对结果行统计分析。计量资料的组间比较用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1 各组细胞FTase、HRAS的mRNA表达
  实时荧光定量PCR检测显示,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组FTase mRNA表达下降(P<0.05)(图1)。各个实验组间FTase mRNA表达比较,以FTase-siRNA-3组的沉默效率最高,作为实验组进一步研究。各组HRAS的mRNA表达无统计学差异(P>0.05)。

  
  图1 各组细胞FTase、HRAS mRNA的表达
  Fig 1 Expression of FTase and HRAS mRNA in each group
  上:CAL27细胞;下:SCC-4细胞。A、B、C、D、E分别代表空白对照组、阴性对照组、FTase-siRNA-1组、FTase-siRNA-2组、FTase-siRNA-3组。左:FTase;右:HRAS。与2个对照组相比,*P<0.05。
  2.2 各组细胞FTase、HRAS的蛋白表达
  Western blot检测结果表明,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组细胞FTase的蛋白表达下降(P<0.05),HRAS的蛋白表达无明显变化(P>0.05)(图2)。

  
  图 2 各组细胞FTase、HRAS蛋白的表达
  Fig2Expression of FTase and HRAS protein in each group
  上:CAL27细胞;下:SCC-4细胞。A、B、C分别代表空白对照组、阴性对照组、实验组。从左至右分别为蛋白质免疫印迹检测结果及FTase和HRAS相对表达量。与2个对照组相比,*P<0.05。
  2.3 各组肿瘤侵袭和血管生成相关蛋白的表达
  Western blot检测结果表明,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组p-p65(S536)、MMP-9、HIF-1α和VEGF的蛋白表达下降(P<0.05),p65的蛋白表达无明显变化(P>0.05)(图3、4)。

  
  图 3 CAL27细胞转染FTase-siRNA后各组蛋白的表达
  Fig 3 The protein expression of each group after FTase-siRNA transfection of CAL27 cells
  上:p65、p-p65(S536)和MMP-9的Western blot检测结果及蛋白相对表达量;下:HIF-1α和VEGF的Western blot检测结果及蛋白相对表达量。A、B、C分别代表空白对照组、阴性对照组、实验组。与2个对照组相比,*P<0.05。
  
  图 4SCC-4细胞转染FTase-siRNA后各组蛋白的表达
  Fig4The protein expression of each group after FTase-siRNA transfection of SCC-4 cells
  上:p65、p-p65(S536)和MMP-9的Western blot检测结果及蛋白相对表达量;下:HIF-1α和VEGF的Western blot检测结果及蛋白相对表达量。A、B、C分别代表空白对照组、阴性对照组、实验组。与2个对照组相比,*P<0.05。
  2.4 各组细胞的侵袭能力
  Transwell侵袭实验结果表明,与空白对照组和阴性对照组相比,实验组细胞通过Matrigel胶迁移到小室膜下的数量降低,表明实验组细胞侵袭能力降低(P<0.05)(图5)。

  
  图 5 转染FTase-siRNA后细胞侵袭能力的检

  Fig 5 Evaluation of cell invasion after FTase-siRNA transfection
  上:CAL27细胞;下:SCC-4细胞。左:侵袭细胞结晶紫染色 倒置相差显微镜 × 100;右:侵袭细胞计数。A、B、C分别代表空白对照组、阴性对照组、实验组。与2个对照组相比,*P<0.05。

  2.5 各组细胞的迁移能力
  细胞划痕实验结果见图6。实验组24 h和48 h划痕相对愈合面积低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05),表明实验组迁移能力降低(图6)。

  
  图6 转染FTase-siRNA后细胞迁移能力的检测
  Fig 6 Evaluation of cell migration after FTase-siRNA transfaction
  上:CAL27细胞;下:SCC-4细胞。左:细胞划痕实验倒置相差显微镜×40;右:划痕相对愈合面积。A、B、C分别代表空白对照组、阴性对照组、实验组。与2个对照组相比,*P<0.05。

  3 讨论

  舌鳞状细胞癌是最常见的口腔癌,生长快、浸润性强、颈淋巴结转移率高,是导致舌鳞状细胞癌患者死亡率高的重要原因。因此,深入探讨其侵袭和转移的机制意义重大。RAS家族成员(HRAS、KRAS、NRAS)是人类癌症中最常见的突变癌基因。亚洲人群口腔癌中以HRAS突变率最高,而西方国家头颈鳞状细胞癌(包括口腔癌)患者中HRAS的突变率较低(低于5%)[12,21]。HRAS基因的突变和高表达可成为启动肿瘤发生的关键因素[22]。此外,有研究[23-24]表明,HRAS不仅在实体瘤的发生中起作用,而且在肿瘤维持中也起着重要作用。McDonald等[25]研究发现,HRAS的表达与头颈鳞状细胞癌更大的瘤体和更晚的肿瘤分期相关,预示着预后不良。
  Ras蛋白必须通过翻译后修饰与细胞膜结合,才能获得其致癌活性。1995年Kohl等[26]动物研究表明,在HRAS突变的转基因小鼠乳腺和唾液腺肿瘤中应用FTase抑制剂可抑制肿瘤的生长。另有研究[27]表明,基因敲除GGTase-Ⅰ或FTase可抑制KRAS诱导小鼠肺癌发展,延长小鼠生存时间。令人遗憾的是,已进入三期临床试验的两种FTase抑制剂(lona-farnib和tipifarnib)无论是单独还是联合卡铂、紫杉醇或吉西他滨都无法改善晚期胰腺癌、晚期结肠癌、晚期非小细胞肺癌或急性髓系白血病的预后。由于KRAS或NRAS可以被二牛龙牛儿基转移酶Ⅰ旁路修饰,而HRAS只能被FTase修饰[28]。所以这种差异的原因可能是进入临床实验这些患者肿瘤多是与KRAS或NRAS突变有关而非与HRAS突变有关。对于HRAS突变或高表达的口腔癌应用FTase抑制剂可能有较好的临床疗效。本实验结果表明,体外沉默FTase后,HRAS的mRNA和蛋白表达无明显变化(P<0.05)。推测其原因是FTase主要影响HRAS的法尼基化修饰和膜定位,并不影响HRAS的表达。

  MMP-9是基质金属蛋白酶家族中的一员,属于Ⅳ型胶原酶,可以降解基底膜的必要成分Ⅳ型胶原和层黏连蛋白,因此被认为是癌症进展的关键调节剂,在乳腺癌、胰腺癌和舌癌的侵袭和转移中发挥重要作用[29]。研究[30]表明,洛伐他汀通过抑制RAS翻译后修饰和功能,可以抑制NIH3T3和v-H-Ras转化的NIH 3T3成纤维细胞的侵袭和MMP-9表达。其机制被认为是洛伐他汀通过降低受Ras调控的启动子元件AP-1和NF-κB的结合活性来影响MMP-9基因表达,然后抑制MMP-9活性和细胞侵袭。此外,应用FTase抑制剂manumycin A同样可抑制NIH3T3和v-H-Ras转化的NIH 3T3的侵袭和MMP-9表达。Takada等[31]研究发现,FTase抑制剂SCH66336可通过抑制IκB磷酸化和降解来抑制NF-κB活化。NF-κB已被证明与HRAS致癌基因激活的异常细胞增殖和致瘤性密切相关[15-16]。Ras的过度表达可增强肿瘤坏死因子诱导的NF-κB活化[31]。研究[32]发现,在头颈鳞状细胞癌中抑制NF-κB后,与细胞转移相关的蛋白质MMP-9和VEGF表达降低。哺乳动物NF-κB家族有5种蛋白,分别为RelA(p65)、RelB、c-Rel、p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)。最常见的NF-κB二聚体是RelA(p65)和p50组成的异二聚体[33]。p65磷酸化可能是有转录能力核NF-κB所必需的[34-35]。本研究显示,沉默FTase后,细胞迁移和侵袭能力降低,p65蛋白表达量不变,p-p65(S536)、MMP-9和VEGF蛋白表达降低。笔者推测沉默FTase后,HRAS翻译后修饰和功能受到抑制,并通过下游NF-κB通路影响了细胞侵袭。
  Oncomine数据库(http://www.oncomine.org)是目前世界上最大的肿瘤基因芯片数据库和整合数据提取平台。通过检索Oncomine数据库中FTase β亚单位编码基因FNTB,其TCGA头颈鳞状细胞癌数据集中显示FNTB与HIF1α的共表达相关系数为0.982,其相关系数较接近1,表明FNTB与HIF1α表达相关性很高。舌鳞状细胞癌是头颈鳞状细胞癌中常见恶性肿瘤之一,推测在舌癌中,FNTB与HIF1α可能也有很高的表达相关性。研究[36]发现,FTase抑制剂SCH66336在低氧、胰岛素样生长因子(insulin like growth factor,IGF)刺激和未刺激的非小细胞肺癌和头颈鳞状细胞癌细胞系和人脐静脉内皮细胞中均表现出抗血管生成活性,并降低HIF-1α和VEGF的表达。但FTase调控HIF-1α和VEGF表达的具体机制有待进一步研究。此外,研究[18-19]表明,在口腔癌中HIF1α调控血管生成和VEGF的表达。本研究显示,沉默FTase后,HIF-1α和VEGF的表达降低,表明在舌鳞状细胞癌中FTase可能通过调控HIF-1α影响血管生成。
  综上所述,本研究通过舌鳞状细胞癌细胞系体外实验显示,沉默FTase可能通过HRAS下游的NF-κB通路影响了细胞的侵袭,并通过对HIF-1α的调控影响血管生成。这提示,FTase在舌鳞状细胞癌的侵袭和血管生成中起着一定调控作用,进一步研究FTase具体作用靶点和作用机制,有利于为控制舌鳞状细胞癌侵袭和血管生成进行靶向治疗提供重要证据。
  利益冲突声明:作者声明本文无利益冲突。

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