铁皮石斛花对亲代及子代大鼠睾丸组织和精子质

医学论文 2020-05-25 14:08132未知xhm
  摘要:目的 研究铁皮石斛花对亲代及子代雄性大鼠睾丸、附睾和精子数量、质量的影响,为评价铁皮石斛花安全性提供依据。方法 设低、中、高3个剂量组和对照组,每组10只SD雄性大鼠,各剂量组以喂饲方式给予含2.0、4.0、6.4 g/kgbw铁皮石斛花的基础饲料。喂饲3个月后测定亲代(P)及子一代(F1)和子二代(F2)大鼠体重、睾丸、附睾脏器重并计算脏体比;显微镜下观察精子数量、活动率和畸形率;采用苏木精-伊红染色法观察睾丸、附睾组织的组织学形态。结果 各组P、F1和F2雄性大鼠体重、睾丸重、睾丸体比、附睾重、附睾体比、精子数量和精子活动率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。高剂量组P、F1、F2雄性大鼠精子畸形率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。P、F1和F2雄性大鼠睾丸和附睾组织形态均无明显的改变。结论 铁皮石斛花对亲代及子代雄性大鼠睾丸组织和精子数量、质量均未见明显不良影响。
  关键词:铁皮石斛花; 大鼠; 精子; 睾丸; 安全性评价;

  铁皮石斛通常是指铁皮石斛干燥的茎,具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗氧化和抗衰老作用[1-4]。为充分开发利用这一传统珍稀植物,茎以外的其他部位(花、叶、根)研究日益受到关注。有文献报道铁皮石斛花具有滋阴、降血压作用,可改善甲亢型小鼠阴虚症状[5-7],有学者对铁皮石斛根、茎、叶和花中黄酮碳苷类和糖类成分进行研究,发现铁皮石斛茎、叶、花中黄酮类成分具有较高抗氧化活性,尤其是铁皮石斛花黄酮[8-10],为开发利用铁皮石斛花代替茎入药提供了可能性。虽然有一些关于铁皮石斛茎及其制品的毒理学安全性研究报道[11-15],但传统上铁皮石斛花为非食用部位,毒理学研究尤其是生殖毒性方面研究较少,本研究选用铁皮石斛花喂饲亲代及子代SD雄性大鼠,探讨其对雄性大鼠精子质量、睾丸和附睾组织的病理学影响,为评价铁皮石斛花安全性提供依据。

  1 材料与方法

  1.1 受试物
  新鲜铁皮石斛花晒干粉碎后的粗粉,80目过筛,黄棕色,纯度>98%,批号为110323,置阴凉干燥处保存。
  1.2 实验动物
  SD大鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,实验动物生产许可证号为SCXK(沪)2007-0005,清洁级,体重80~100 g。饲料由浙江实验动物中心提供,执行标准GB 14924.3—2001《实验动物小鼠大鼠配合饲料》[16]。检测环境条件为屏障环境,实验动物使用许可证号为SYXK(浙)2008-0106,温度为20~25℃,相对湿度为40%~70%。实验前大鼠在动物房环境中适应5 d。
  1.3 分组与处理
  设低、中、高3个剂量组和对照组。各剂量组受试物分别为2.0、4.0、6.4 g/kgbw,按大鼠体重8%折算,均匀拌入基础饲料(加入酪蛋白调整饲料蛋白质比例)喂饲大鼠;对照组仅喂饲基础饲料。SD雌性大鼠80只,雄性40只,随机分为4组,每组雌性20只,雄性10只。单笼饲养,自由进食、饮水。亲代(P)及子代(F)大鼠均给予相同剂量受试物、饲料和水,子一代(F1)和子二代(F2)仔鼠喂饲基础饲料的记为F1a、F2a,喂饲含受试物饲料的记为F1b、F2b。实验参照GB 15193.15—2015《食品安全国家标准生殖毒性试验》[17]操作。
  1.4 大鼠睾丸组织和精子质量指标检测
  连续喂饲受试物约3个月后,取P、F1和F2雄性大鼠测定:(1)睾丸、附睾脏器重和脏体比。雄性大鼠大体解剖分离睾丸、附睾,滤纸吸干,立即称重并计算脏体比。(2)附睾尾精子数。取单侧附睾尾制备精子悬液,滴入血细胞计数板,按血细胞计数方法计数精子数,尾中的精子浓度用“/g附睾”表示。(3)精子活动率。将悬液置于37℃恒温水浴孵育20 min,用高倍镜计数200个精子,计算精子活动率。(4)精子畸形率。取1滴悬液推片,甲醇固定,伊红染色,晾干后镜检。仅检测对照组和高剂量组。每只大鼠观察1 000个头尾完整的精子及其中畸形精子数量,计算畸形率。(5)睾丸和附睾组织形态。将固定好的睾丸、附睾组织横切,睾丸中部取一段,附睾头、体、尾各取一段,厚度约0.3~0.4 cm组织块石蜡包埋,切片厚度3μm,苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察组织学形态。
  1.5统计分析
  采用SPSS 15.0软件统计分析。定量资料服从正态分布的采用均数±标准差(±s)描述,精子活动率采用进行数据转换,组间比较采用单因素方差分析,若方差不齐则采用Kruskal-Wallis H检验。精子畸形率采用中位数和四分位数间距[M(QR)]描述,组间比较采用Mann-Whitney U检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1 亲代雄性大鼠睾丸组织和精子质量比较
  4组P雄性大鼠体重、睾丸重、睾丸体比、附睾重和附睾体比比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。各组P雄性大鼠的精子数量和精子活动率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。高剂量组P雄性大鼠精子畸形率与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
  表1 4组P雄性大鼠体重、睾丸重、附睾重及脏体比比较(±s)

  
  表2 4组P雄性大鼠精子数量、精子活动率和精子畸形率比较
  
  镜下观察对照组与高剂量组P雄性大鼠睾丸组织结构清晰,曲细精管排列整齐,未见萎缩,各级生精细胞有序,数量正常,成熟精子丰富,支持细胞规则分布于生精细胞之间,间质细胞形态正常,分布于曲细精管之间。两组附睾组织学结构正常,发育良好,附睾管和输出管管腔规则,腔面平整,腔内可见大量染色均匀的精子,形态正常。两组睾丸、附睾组织形态结构均未见明显异常,差异也不明显。
  2.2 子代雄性大鼠睾丸组织和精子质量比较
  各组F1和F2雄性大鼠体重、睾丸重、睾丸体比、附睾重和附睾体比比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3和表4。

  表3 4组F1a、F2a雄性大鼠体重、睾丸重、附睾重及脏体比比较(±s)
  
  表4 4组F1b、F2b雄性大鼠体重、睾丸重、附睾重及脏体比比较(±s)
  
  各组F1、F2雄性大鼠精子数量和精子活动率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。高剂量组F1和F2雄性大鼠精子畸形率与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表5和表6。
  表5 4组F1a、F2a雄性大鼠精子数量、精子活动率和精子畸形率比较
  
  表6 4组F1b、F2b雄性大鼠精子数量、精子活动率和精子畸形率比较
  
  镜下观察对照组与高剂量组F1、F2大鼠睾丸组织结构清晰、白膜完整,曲细精管排列整齐,紧密有序,基底膜、精原细胞及多层的初级精母细胞和次级精母细胞清晰可见,各级生精细胞有序,成熟精子丰富,支持细胞规则分布于生精细胞之间,间质细胞呈圆形或椭圆形,分布于曲细精管之间。两组附睾组织学结构正常,发育良好,未见间质炎细胞浸润,附睾管和输出管管腔规则,未见萎缩,附睾管上皮腔面平整,平滑肌丰厚,腔内可见大量染色均匀的精子,形态正常。两组睾丸、附睾组织形态结构均未见明显异常,差异也不明显。

  3 讨论

  评价某化学物是否对精子发生产生有害作用主要通过睾丸形态学评价和精子发生功能评价。睾丸形态学评价可提供有关靶细胞形态学的信息,生精小管组织学可了解细胞的完整性并提供生精过程的信息[18],精子数量和质量下降会引起不育,而精子活力是男性生育力的重要参数[19-20]。与雄性生殖系统相关的许多内分泌和生化反应的干扰作用,很少在一次暴露于某种(些)化学物后发生,因此检测化学物持续多重暴露(如二代接触)后的生殖毒性很有必要。
  本研究观察长期喂饲铁皮石斛花对亲代和子代大鼠精子和睾丸组织的影响,实验结果显示各组亲代和子代大鼠精子数量、精子活动率和精子畸形率差异均无统计学意义,同时病理组织学检查结果显示高剂量组和对照组大鼠睾丸、附睾组织结构均正常,发育良好,两组间未见明显差异,表明铁皮石斛花对亲代和子代雄性大鼠生殖能力无明显不良影响。今后可进一步结合铁皮石斛花其他毒理学研究结果,如致突变性、亚慢性毒性和致畸性等以及流行病学研究资料,进行全面的安全性毒理学评价。

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